Metabolit sekunder sebagai bahan baku pengembangan obat modern dibutuhkan terutama untuk penyakit kronis diantaranya diabetes melitus. Bahan alami berpotensi sebagai antidiabetes adalah madu rambutan yang mengandung flavonoid rutin dan diduga mampu melindungi sel beta pankreas dengan mengurangi stres oksidatif. Penelitian ini bertujuan mengisolasi komponen aktif flavonoid (rutin) dari madu rambutan sebagai bahan baku untuk pengembangan obat diabetes melitus. Penyiapan isolat dilakukan dengan mengekstraksi cair-cair madu diikuti dengan memfraksinasi dengan masing-masing pelarut air, n-heksana, dan etil asetat. Hasil fraksinasi dianalisis dengan kromatografi lapis tipis(KLT) pada plat prasalut Kiesel gel GF254. KLT preparatif dilakukan terhadap fraksi etil asetat menggunakan Plat Preparatif silica gel 60 GF254. Kemurnian Isolat diuji dengan KLT dua arah dengan menggunakan rutin trihidrat sebagai pembanding. Pola-pola kromatogram menunjukkan bahwa bercak senyawa hanya terdapat pada fraksi etil asetat. Hasil kromatogram uji kemurnian menunjukkan ada satu bercak di pengembangan pertama dan pengembangan kedua yang mengindikasikan bahwa isolat adalah senyawa murni rutin yang identik dengan pembanding.
Kata kunci : isolasi flavonoid rutin, diabetes melitus, madu